目的建立高效液相色譜-柱后光化學(xué)衍生法測(cè)定油茶中黃曲霉毒素含量的方法。方法市售油茶油樣品,經(jīng)80%甲醇水溶液提取、離心,吸取上清液稀釋,專用免疫親和柱凈化后,采用高效液相色譜儀帶熒光檢測(cè)器串聯(lián)柱后光化學(xué)衍生器測(cè)定黃曲霉毒素。同時(shí),對(duì)樣品提取條件的選擇、樣品凈化過程、流動(dòng)性比例選擇等進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)研究。結(jié)果黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2在0.5～50 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)r²＞0.9999,在0.5μg/kg（檢出限）、10μg/kg（*）添加水平下的回收率為88.4%～104.5%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差0.3%～6%。結(jié)論該方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好,適用于油茶中黃曲霉毒素的定量分析。

黃曲霉毒素是迄今發(fā)現(xiàn)的毒性最大的真菌毒素，是科學(xué)界普遍認(rèn)同的3大強(qiáng)致癌物質(zhì)之一。黃曲霉毒素主要污染糧油制品，易在玉米、稻谷、花生、桃仁、果仁、堅(jiān)果等油脂含量較高的糧食作物上生長(zhǎng)。我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2761—2017規(guī)定食用油中黃曲霉毒素B1的*不得高于10μg/kg。目前針對(duì)植物油中黃曲霉毒素的檢測(cè)主要依據(jù)食品中黃曲霉毒素的檢測(cè)方法如：高效液相色譜法、同位素稀釋液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、酶聯(lián)免疫法，茶油中黃曲霉的檢測(cè)相關(guān)文件少之又少。本研究基于HPLC-柱后光衍生的基礎(chǔ)上結(jié)合免疫親和濃縮富集，建立一種準(zhǔn)確、高效的測(cè)定和確證茶油中黃曲霉毒素的方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試驗(yàn)材料

尚野山茶油（油茶籽油-安徽尚野茶油有限公司）；純正茶油（油茶籽油-浙江久晟茶油科技股份有限公司）

1.2 儀器與試劑

高效液相色譜法-帶熒光檢測(cè)器（島津）；光化學(xué)柱后衍生器（Pribolab® KRC光化學(xué)柱后衍生器）；超聲波清洗裝置；渦旋儀；分析天平；固相萃取裝置（
Pribolab® 8位泵流操作架）；黃曲霉毒素免疫親和柱（PriboFast®黃曲霉毒素總量免疫親和柱3ml）。

甲醇（色譜純）；Pribolab® PBS緩沖液；高純水；黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品（Pribolab®25µg/mL黃曲霉毒素(Aflatoxin)B1,G1,B2,G2/甲醇）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 試樣處理 準(zhǔn)確稱取5.00g油樣于 50mL 離心管中，加1.0g氯化鈉；加 25mL70%甲醇水，渦旋混勻，置于超聲波或渦旋振蕩器中振蕩 30min ；過玻纖濾紙，取5mL濾液，加20mL PBS溶液稀釋混勻，備用。冷藏條件下儲(chǔ)存的黃曲霉毒素免疫親和柱取出后恢復(fù)至室溫，移取上述提取液全部重力過柱，分別用10mL PBS和10mL一級(jí)水加壓清洗，棄去全部流出液，并使 2~3mL 空氣通過柱體；以2.0mL 色譜級(jí)甲醇分兩步進(jìn)行洗脫，重力洗脫。最后輕微加壓排凈洗脫液，0.22μm 濾膜過濾，待測(cè)。

1.3.2 分析條件 色譜柱：PRIBOLAB ODS C18液相色譜柱（5μm，4.6mm×150mm）；流動(dòng)相：甲醇：水=45：55，等度洗脫；流速1mL/min；進(jìn)樣量：20μL；激發(fā)波長(zhǎng):360nm；發(fā)射波長(zhǎng):440nm。

2 結(jié)果與結(jié)論

2.1樣品前處理

比較甲醇、乙腈、正己烷后，得出70%甲醇水提取效果較好，溶劑中油脂含量明顯較低，回收率可達(dá)85%以上；由于茶葉基質(zhì)復(fù)雜，在過柱凈化時(shí)，使用0.5%吐溫-PBS稀釋后上樣，可有效減少色素等雜質(zhì)在柱體上的吸附，上樣完畢后，繼續(xù)用PBS溶液進(jìn)行淋洗，淋洗體積可視樣品情況而定，一般需要10mL。如果排出的淋洗液中還有顏色，可適當(dāng)增加淋洗液體積。最后用水再淋洗，以減少表面活性劑對(duì)儀器的不良影響。

2.2 儀器條件

流動(dòng)相選擇甲醇：水=45：55，使用150mm的C18色譜柱，可以在20分鐘出AFTG2、G1、B2、B1四個(gè)峰，串聯(lián)Pribolab® KRC光化學(xué)柱后衍生器增強(qiáng)AFTG1、B1的熒光強(qiáng)度，響應(yīng)高，峰型好。

2.3 工作曲線和最小檢出限

準(zhǔn)確吸取40μL 25μg/mL的黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，用甲醇定容至1mL，制得1μg/mL的儲(chǔ)備液，逐級(jí)稀釋成0.5,1,5,10,50μg/L的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，按濃度由低到高的順序進(jìn)樣，選定的色譜條件下測(cè)定，橫坐標(biāo)為濃度，縱坐標(biāo)為峰面積，進(jìn)行線性回歸計(jì)算。結(jié)果表明黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2在0.5～50 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)r²＞0.9999。計(jì)算3倍信噪比時(shí)所對(duì)應(yīng)的樣品濃度，得到的方法檢出限為0.05μg/kg、0.03μg/kg、0.1μg/kg、0.04μg/kg。

黃曲霉毒素G2 G1 B2 B1標(biāo)準(zhǔn)曲線、回歸方程、相關(guān)系數(shù)

1μg/L 與 茶油樣品0.5μg/L添加的液相譜圖

2.4 精確度與回收率

兩種茶油樣品，分別做了0.5μg/kg（檢出限）、10μg/kg（*）的添加，10μg/kg的樣品都做了平行實(shí)驗(yàn)。方法的回收率為88.4%～104.5%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.3%～6%。

兩種茶油樣品液相檢測(cè)峰面積、濃度、回收率數(shù)據(jù)匯總

3 結(jié)論

此所建立的高效液相色譜-柱后光化學(xué)衍生法測(cè)定油茶中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的方法，用甲醇水提取茶油中的黃曲霉毒素，經(jīng)PriboFast®黃曲霉毒素總量免疫親和柱凈化和富集，在高效液相色譜串聯(lián)Pribolab® KRC光化學(xué)柱后衍生器檢測(cè)下，黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的檢出限可達(dá)0.05μg/kg、0.03μg/kg、0.1μg/kg、0.04μg/kg，滿足《GB2761-2017-真菌毒素*》要求。